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GENETIK

Anwendung der Gentechnik in der Kriminalistik (4)

PCR

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Identifizierung und Kartierung des Genoms

Genotypisierung:

Unter dem Begriff Genotypisierung versteht man die Anfertigung eines genetischen Profiles, eines genetischen Fingerabdruckes, der eine eindeutige Zuordnung zulässt, wie etwa: Aus welcher Zucht stammt dieses Tier, von welchem Saatgut stammt diese Pflanze oder von welchem Menschen stammt ein Bluttropfen.

Diese molekulargenetische Identifikation kann nicht nur für phylogenetische Fragestellungen verwendet werden, diese Stammbaumanalysen sind beispielsweise für Zoos von Interesse. Es können Inzuchteffekte vermieden werden, und für die Wissenschaft wichtige Fragestellungen erfahren dadurch eine Klärung. Der Genetische Fingerabdruck erlaubt auch den Herkunftsnachweis.

Eine gerade durch mehrere Skandale sensibilisierte Bevölkerung wird verstärkt wissen wollen, woher die Nahrungsmittel kommen und DNA-Analysen sind das Mittel der Wahl, um rasch und effizient diese dringenden Fragen zu beantwor-ten.

Minisatelliten-Analyse (Southern Blot):

Das wichtigste Werkzeug bei der Southern Blot-Analyse von RFLP-Systemen sind bestimmte Eiweißstoffe, Restriktionsenzyme genannt, die aus Bakterien isoliert werden, und die wie chemische Scheren die DNA an ganz bestimmten Stellen schneiden können.

"RFLP" bedeutet "restriction fragment length polymorphism". Gemeint ist, dass jeder Mensch auf der Erde ein ganz spezielles Muster an DNA-Fragmentlängen aufweist.

Als Erkennungsmuster für diese Enzyme dienen bestimmte Basensequenzen, die mehr oder weniger zufällig verstreut auf dem DNA-Molekül vorkommen. Wenn nun die DNA in den flankierenden Bereichen von Minisatellitensequenzen geschnitten wird, so entstehen DNA-Fragmente, deren Länge abhängig ist von der Anzahl der Minisatelliten-Wiederholungseinheiten. Bei der Southern-Blot-Analyse werden DNA-Fragmente, die durch Behandlung mit den schneidenden Enzymen entstanden sind, in einer Elektrophorese nach ihrer Länge getrennt, auf eine Membran übertragen und mittels radioaktiv oder Enzym-markierter "DNA-Sonden" die nur die gesuchten Fragmente erkennen können, sichtbar gemacht. So entstehen RFLP-Muster, deren Zusammensetzung typisch für ein einzelnes Individuum ist. Die beiden Merkmale eines jeden Genortes lassen sich dabei jeweils von der Mutter bzw. vom Vater ableiten.

PCR

Der Nachteil der DNA-Analysetechnik ist die Menge benötigter DNA (5-10 µg). Das ist bei Vaterschaftsfällen kein Problem. Bei winzigen Blut-, Sperma oder Speichelspuren liegt jedoch eine nicht überwindbare Mengenbeschränkung vor.

Daher nutzen die Labors die Methode der DNA-Vervielfältigung durch die Po-lymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR), für deren Entwicklung KARY MULLIS 1993 den Nobelpreis erhielt. Durch die Wahl geeigne-ter DNA-Startermoleküle wird bei der PCR-Typisierung nicht das gesamte Genom zerschnitten und aufgetrennt, sondern es werden ausgewählte DNA-Strecken vervielfältigt.

Analyse mittels PCR

PCR ist ein in vitro (Reagenzglas-) Verfahren zur gezielten Vermehrung von DNA mit Hilfe von synthetischen Oligonukleotiden und dem Enzym DNA-Polymerase. Durch wiederholte Zyklen wird aus einer DNA-Lösung ein spezifi-scher DNA-Abschnitt vermehrt.

Synthetische Oligonukleotide (eine nur kurze Reihe von Basen auf der DNA) definieren den DNA-Abschnitt, der vervielfältigt werden soll. Sie werden PCR-Primer genannt, da nach ihrer Anlagerung an einen DNA-Einzelstrang von ihrem Ende ausgehend das Enzym DNA-Polymerase den komplementären Strang neu synthetisieren kann.

Die Primer für ein bestimmtes PCR-System werden so gewählt, dass sie den zu untersuchenden Abschnitt der DNA einschließen. Damit die DNA-Neusynthese stattfinden kann, müssen neben den bereits erwähnten Primern und der Polymerase auch die vier verschiedenen reaktiven DNA-Bausteine, die so genannten Nukleotide, im Reaktionsgemisch vorhanden sein.

Die eigentliche PCR-Reaktion findet in kleinen Reaktionsgefäßen in einem so genannten Thermocycler statt.
Am Beginn jedes PCR-Zyklus steht eine Denaturierung der Doppelstrang-DNA durch Erwärmung auf eine Temperatur über 90°C, wodurch die beiden komplementären DNA-Stränge voneinander getrennt werden.

Als nächster Schritt wird das Reaktionsgemisch auf eine für die beiden Primer spezifische Temperatur zwischen 50°C und 65°C abgekühlt. Bei dieser Temperatur könnten sich die PCR-Primer an die DNA-Einzelstränge anlagern. Die Temperatur muss so gewählt werden, dass sich die Primer nur dort anla-gern, wo ihre Sequenz vollständig mit der des DNA-Einzelstrangs übereinstimmt.

Im dritten Schritt des PCR-Zyklus, bei ca. 72°C, findet schließlich ausgehend von den Enden der Primer eine komplementäre Ergänzung der DNA-Einzelstränge statt, wodurch in diesem Bereich ein DNA-Doppelstrang entsteht.

In jedem Folgezyklus findet nunmehr erneut eine Verdopplung dieses DNA-Abschnitts statt, wodurch es zu einer exponentiellen Vermehrung der Zielsequenz kommt. Typischerweise werden bei PCR-Vermehrung 28 - 32 Zyklen durchgeführt. Daraus errechnet sich theoretisch ausgehend von einer einzel-nen Kopie zu Beginn der PCR, dass am Ende nach 32 Zyklen 2 Milliarden Kopien des zu untersuchenden DNA-Abschnittes vorliegen. Tatsächlich kann man jedoch nicht mit einer 100%igen Verdopplung pro Zyklus rechnen. Realistische Werte liegen zwischen 70 und 90 %. Bei einer durchschnittlichen Effizienz von 80% errechnen sich nach 32 Zyklen 5 Mio. Kopien der Ausgangskopie der DNA. Dies reicht für eine Analyse mittels Elektrophorese.

Kapillar-Elektrophorese:

In der Gel - Elektrophorese wandern geladene, biologische Moleküle im elektrischen Feld. Die in Protonen und konjugierte Basen zerfallene DNA wandert vom negativen zum positiven Pol. Je nach Form und Größe wandern die die kleineren Moleküle, die die Gelporen schneller passieren, schneller als Größere.

Die Analyse der PCR-Produkte, welche sich durch die Anwesenheit von Mikrosatelliten-Polymorphismen in ihrer Länge unterscheiden, erfolgt durch eine automatische Fragmentanalyse mittels Kapillar-Elektrophorese.

Die DNA-Fragmente mit den Repeat-Merkmalen werden an der Kathode (-) auf-getragen und wandern bei Anlegen einer Hochspannung durch ihre eigene negative Ladung in die Kapillare in Richtung Anode (+) ein. In der Kapillare befindet sich ein flüssiges Polymer, dass wie ein Sieb die Fragmente sortiert und bei fortschreitender Wanderung durch die Kapillare auftrennt.

Die PCR-Produkte (DNA-Teile) werden durch die Verwendung jeweils eines PCR-Primers für jedes System sichtbar gemacht, der mit einem Fluoreszenzfarbstoff (blau, grün oder gelb) markiert worden ist. Weiterhin wird ein mit rotem Farbstoff markierter interner DNA-Längenstandard zugefügt, der zur Messung der PCR-Produkte unbekannter Fragmentlänge benötigt wird. Wandern nun die markierten DNA-Fragmente der zu untersuchenden Probe aufgrund der Polarität des elektrischen Feldes der Elektrophorese durch das in der Kapillare befindliche gelartige Polymer von der Kathode zur Anode, werden sie der Länge nach aufgetrennt, d.h. die kleinen Fragmente können schneller durch das Gel dringen als die großen Fragmente. Sobald diese Fragmente am Fenster des Detektors vorbeiwandern, werden die Farbstoffmoleküle durch einen Laser-strahl zur Fluoreszenz angeregt. Diese Fluoreszenz wird nun durch ein optisches System auf einen Detektor mit CCD-Kamera gebracht und dort nach Wellenlänge und Signalstärke in digitale Messwerte umgewandelt.

 

Diese Werte werden schließlich mittels EDV-Analyse mit den bekannten Fragmentlängen des internen Standards verglichen und dann den Allelen der einzelnen DNA-Systeme gestaffelt nach Farbmarkierung und Fragmentlänge zugeordnet.

 

Abb.: Beispiel für DNA-Fragmente, die durch Elektrophorese getrennt wurden.

Spur 1 zeigt die Banden der DNA-Fragmente des DNA-Markers III, der durch Schneiden des DNA-Fadens des Bakteriophagen Lambda (Lambda-DNA) mit dem Restriktionsen-zymen Eco RI und Hind III entstanden ist. Den Banden sind jeweils die Basenpaare (bp) der Fragmente zugeordnet.
Spur 2 zeigt die Bande der ungeschnittenen DNA des Plasmids pBR322 (p=Plasmid, BR = Bolivar und Rodrigues, die 1977 das Plasmid entwickelten, 3 = Plasmid besteht aus drei Teilen, 20 = in einem Bakterium können bis zu 20 Plasmide kopiert werden, 2 = 2 Gene für Antibiotikaresistenzen)
Spur 3 zeigt die Bande des Restriktionsansatzes: den mit Nhe I einmal aufgeschnitte-nen Plasmidring von pBR322, die jetzt linear vorliegende DNA. Das Restriktionsenzym NheI wurde aus Neisseria mucosa subspecies heidelbergensis isoliert.
Spur 4 die Bande des Plasmids pBR322 lacZ+, Plasmidring pBR322 mit eingebautem lacZ+-Gen. Die DNA kommt dabei in zwei Zuständen vor: als Supercoil-Plasmid und als zirkulärer Plasmid. Die verdrillte Supercoilform durchdringt das Gel schneller als die lineare und die zirkuläre DNA.

(Aus: http://www.uni-koblenz.de/~odsgroe/dnaanaly.htm)

Der DNA-Chip

Kontinuierlich werden die Analysemethoden verbessert. So gelang Wissenschaftlern des Kriminaltechnischen Instituts des deutschen Bundeskriminalamtes Ende Mai ein Durchbruch bei der Untersuchung von Spurenmaterial. Sie entwickelten eine Methode, die eine Kern-DNA-Untersuchung an ausgefallenen Haaren ermöglicht. Bisher konnten nur ausgerissene Haare einer solchen DNA-Analyse unterzogen werden, doch 95 Prozent der sicher gestellten Haarspuren waren ausgefallene Haare.

Dies ist jedoch nichts im Vergleich zur jüngsten Entwicklung der kalifornischen Biotechnologie-Firma Nanogen in San Diego. Sie verfügt bereits über einen Chip, der die Identifizierung von DNA erheblich beschleunigen wird. Dabei handelt es sich bereits um einen voll funktionsfähigen Prototypen, der indivi-duelle DNA-Unterschiede entdecken kann.

Die Nanogen-Analyseeinheit ist für den einmaligen Gebrauch gedacht. Sie enthält einen Halbleiter-Mikrochip mit elektrischen und flüssigen Verbindungen. Mehrere Prototypen wurden bereits gefertigt, die Fertigungspläne wurden nach Angaben der Firma bereits abgeschlossen. Nanogen-Experten erwarten, dass das Gerät künftig in Massen zu niedrigen Kosten gefertigt werden kann.

Derzeit konzentrieren sich die Anstrengungen darauf, die Zahl der genetischen Marker zu erhöhen, um die identifizierten DNA-Datensätze in die US-Datenbank CODIS (Combined DNA Index System) einspielen zu können. Wenn dies soweit ist, soll der Chip in einer feldfähigen, tragbaren Einheit integriert werden.

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